Mối quan hệ giữa vi sinh vật trong ao và bệnh phân trắng

“Có gì trong nước?” Nghiên cứu về hệ vi sinh vật  trong ao nuôi tôm và mối quan hệ của chúng với việc bùng phát hội chứng phân trắng.

1. Ảnh hưởng của môi trường đến sức khỏe tôm

Sức khỏe tôm phần lớn là bị ảnh hưởng bởi chất lượng nước và sự đa dạng của vi sinh vật quần thể trong nước nuôi.

Vi khuẩn xâm chiếm tôm đến từ nước nuôi và trầm tích. Chứng cứ gợi ý rằng môi trường là các yếu tố ảnh hưởng đến đối tượng nuôi bao gồm nitrat, nitrit, amoniac, độ mặn, pH,

hòa tan O và CO (Xiong 2, 2 2016). Hệ vi sinh vật tác động đến sự phát triển và tăng trưởng, hệ thống miễn dịch, dinh dưỡng và các quá trình trao đổi chất và ức chế vi khuẩn gây bệnh.

Từ năm 2009, hội chứng phân trắng (WFS) đã gây ra tổn thất đáng kể cho ngành tôm ở Đông Nam Bộ Châu Á.

Hội chứng phân trắng là thường xuất hiện  trong khoảng 40-50 ngày nuôi tôm, ảnh hưởng tôm trưởng thành. Dấu hiệu lâm sàng của WFS là chán ăn, một đoạn ruột giữa trắng hoặc trống, giảm sự phát triển, các chuỗi phân trôi nổi, và tỷ lệ tử vong cao (Hình 1).

 

2. Hội chứng phân trắng (WFS)

Ban đầu, Enterocytozoon hepatopenaei (EHP) là được xác định là nguyên nhân gây ra bệnh WFS vì nó phổ biến ở các ao bị ảnh hưởng.

Enterocytozoon hepatopenaei là vi bào tử nội bào sao chép trong ống của gan tụy gây ra

các triệu chứng tương tự như WFS không có dây phân. Hơn nữa- điều tra xác định rằng sự đồng nhiễm của tôm với EHP và chủng V. parahaemolyticus (toxR+, APHND-) đã gây ra hiện tượng các chuỗi phân màu trắng có liên quan đến WFS nhưng lại không bị nhiễm trùng

loài riêng biệt. Gần đây thuật ngữ pathobiome đã được sử dụng để mô tả ý tưởng

cộng đồng vi sinh vật đó tương tác với vật chủ, với kết quả tiềm năng là có lợi hoặc có hại.

3. Sự thay đổi của hệ vi sinh vật trong ao nuôi bị nhiễm WFS

Trong tôm, nhiễm EHP thay đổi cân bằng sinh hóa, ảnh hưởng đến phản ứng miễn dịch, và làm thay đổi tính toàn vẹn của gan tụy cho phép mầm bệnh cơ hội xâm chiếm và gây bệnh

(Piamsomboon 2022).

Bệnh WFS thường xuất hiện ở thời điểm 40-50 ngày nuôi cấy thì không đáng ngạc nhiên. Khi động vật già đi nước ao đang xấu đi thông qua một quá trình phú dưỡng hóa. Thức ăn thừa và chất thải hữu cơ tăng lên hàm lượng chất hữu cơ của nước nuôi. Cái này dẫn đến sự gia tăng vi khuẩn tham gia vào quá trình suy thoái của chất hữu cơ và quá trình nitrat hóa, làm giảm độ pH và độ kiềm của nước làm tăng CO2. Một nghiên cứu từ Indonesia báo cáo rằng WFS xuất hiện ở  ao có pH thấp hơn (7,71-7.84) và oxy hòa tan (< 6mg ml-1) khi so với ao khỏe mạnh (pH> 8 và oxy hòa tan > 6 mg,ml-1) (Piamsomboon 2022).

Chất lượng nước và hệ vi sinh vật của nước ao nuôi và tôm đều ảnh hưởng quan trọng để thành công và việc nuôi trồng thủy sản bền vững. Eubiosis mô tả một điều kiện trong đó vật chủ duy trì hệ vi sinh vật cân bằng chống lại mọi sự gián đoạn từ các yếu tố bên trong hoặc bên ngoài. Ví dụ, khi đường ruột của tôm khoẻ mạnh  có thể bị vi khuẩn Vibrio spp tiêu hóa chitin chiếm ưu thế, có thể sống chung trong ruột vật chủ mà không gây bệnh. Từ đó là một không gian hữu hạn trong ruột dành cho sự xâm chiếm, vi sinh vật và hợp chất kháng khuẩn có thể hạn chế sự phát triển của loài gây bệnh. Một đánh giá cao hệ vi sinh vật đa dạng có thể chống lại mầm bệnh tiềm ẩn nhưng khi mất đi sự đa dạng của vi sinh vật thì vi khuẩn gây bệnh sẽ  xâm chiếm ruột  và  gây bệnh.

Tuy nhiên, giống như trường hợp của WFS, các loài sinh học và vật lý, chất lượng nước, tuổi tôm và kỹ thuật nuôi có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong cả tôm và nước trong ao nuôi.

Hệ vi sinh vật trong nước phát triển theo những thay đổi về chất lượng nước và sự đa dạng của các loài vi khuẩn phản ứng với áp lực môi trường.

Mục tiêu của chúng tôi là thu thập dữ liệu hệ vi sinh vật từ các ao bị nhiễm WFS, nghiên cứu sự đa dạng của hệ vi khuẩn trong suốt quá trình mắc bệnh và xác định các tác nhân gây ra chứng loạn khuẩn từ những thay đổi trong hàm lượng vi khuẩn trong ao nuôi.

Kiến thức này sẽ cho phép phát triển các phác đồ điều trị để phục hồi sự đa dạng của vi khuẩn

trong ao và tôm. những thay đổi do EHP gây ra đã dẫn đến sự suy giảm tính đa dạng của

hệ vi sinh vật đường ruột. Dysbiosis là thuật ngữ được sử dụng để mô tả tình trạng mất sự đa dạng của vi khuẩn và sự cân bằng của vi khuẩn (Holt 2021).

Đối với nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn hai ao ở Ấn Độ từ cùng một trang trại có chung nguồn nước giếng khoan. Các ao được thả tôm thẻ chân trắng Litopenaeus vannamei và cả hai ao đều biểu hiện các dấu hiệu của WFS. Ao A2 được lấy mẫu ở 60 ngày nuôi (DOC), có

độ pH là 7,8 và bị nhiễm WFS nghiêm trọng. Ao A4 được lấy mẫu ở 49 DOC, có độ pH là 8,3 và đang trong giai đoạn đầu của WFS. Chúng tôi đã thiết lập một phương pháp để thu thập hệ vi sinh vật trong ao trên các bộ lọc Sterivex™-GP từ 150 ml nước ao. DNA đã được tinh chế từ các bộ lọc để phát hiện PCR các loài EHP và Vibrio liên quan đến WFS và để giải trình tự Amplicon có mục tiêu.

Chúng tôi đã xác nhận sự hiện diện của các vi khuẩn là một phần của hệ vi sinh vật gây bệnh cho WFS thông qua phân lập khuẩn lạc và PCR.

Enterocytozoon hepatopenaei không thể nuôi cấy, do đó không thể phân lập khuẩn lạc nhưng có thể sử dụng PCR của DNA đã phân lập để phát hiện sự hiện diện hoặc không có của nó.

Phân lập khuẩn lạc từ Ao A2 và Ao A4 bao gồm các phân lập V. parahaemolyticus toxR+ (VPtoxR+) và một số loài Vibrio spp. toxR- chưa biết. Ngoài ra, Ao A4 còn chứa V. alginolyticus toxR+ và toxR-. Phân tích phản ứng chuỗi polymerase (PCR) của DNA từ Ao A2 và Ao A4 đã xác định được sự hiện diện của EHP và toxR+368, điều này được mong đợi do trạng thái WFS của chúng (Caro 2021).

Sau khi xác nhận WFS bằng hình ảnh và bằng các quy trình phân tử chúng tôi quan tâm đến việc nghiên cứu hệ vi sinh vật của hai ao ở các giai đoạn nhiễm trùng khác nhau và so sánh kết quả với các nghiên cứu đã công bố. Ngày càng có nhiều nghiên cứu về hệ vi sinh vật

của hệ tiêu hóa của các loài tôm và nước nuôi được thực hiện và đánh giá (Palaniappan và cộng sự 2024, Chen và cộng sự 2020, Cornejo-Granados 2018, Yu 2018, Holt 2021). Việc tìm ra sự đồng thuận từ các nghiên cứu này là một thách thức vì sự khác biệt trong các quy trình thử nghiệm và các công cụ sinh học được triển khai trong các nghiên cứu khác nhau có thể ảnh hưởng đến kết quả. Vị trí địa lý, loài tôm, chất lượng nước, tuổi tôm và kỹ thuật nuôi

có thể ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật trong cả tôm và nước trong ao nuôi.

Lượng dữ liệu do metagenomics tạo ra rất lớn và việc phân tích và báo cáo dữ liệu rất phức tạp. DNA được phân lập từ các bộ lọc đã được gửi đến Charles River Microbial Solution Services để xác định vi khuẩn dựa trên NGS TAS của họ bằng giải trình tự Amplicon 16S/ITS có mục tiêu (NGS-TAS-16S-20), một quy trình được sử dụng để xác định quần thể vi khuẩn.

Mặc dù chúng cung cấp cách giải trình tự nấm, chúng tôi tập trung vào hệ vi sinh vật của vi khuẩn vì hầu hết các nghiên cứu về ruột tôm và nước ao đều tập trung vào quần thể vi khuẩn.

Vì các mẫu được lấy từ các ao biểu hiện các giai đoạn nhiễm trùng khác nhau nên dữ liệu đã được kiểm tra để tìm điểm tương đồng và các thay đổi có thể có trong sự đa dạng của vi khuẩn trong suốt quá trình mắc bệnh.

Giải trình tự đã đưa ra 186.572 lần đọc cho ao A2 và 217.302 lần đọc cho Ao A4 với 57% được phân loại cho cả hai mẫu. Các ao biểu hiện nền vi khuẩn tương tự nhau; Ao A2 có 15 Ngành và ao A4 có 21 Ngành được biểu thị trong quần thể vi khuẩn của chúng.

Sự giống nhau về vi khuẩn không có gì đáng ngạc nhiên vì các ao đều từ cùng một trang trại,  cùng nguồn cung cấp nước, cùng loài tôm và có cùng phương pháp nuôi. Phyla chiếm hơn 1% quần thể vi khuẩn trong cả hai ao là Bacteroidota, Chloroflexota, Cyanobacteriota, Planctomycetota, Pseudomonadota (từ đồng nghĩa Proteobacteria) và Actinomycetota. Actinomycetota và Proteobacteria có tỷ lệ đọc cao từ cả hai ao. Tuy nhiên, ao A2 với bệnh nhiễm trùng nghiêm trọng có khoảng một nửa số lượng Actinomycetota so với ao A4, (lần lượt là 21 % và 45,60 %) trong khi ao A2 có gần gấp đôi số lượng Proteobacteria (45,725 % và 25,95 %).

Actinomycetota, một Ngành đa dạng của vi khuẩn gram dương, là vi khuẩn khử nitơ, sản xuất vitamin và sản xuất các chất chuyển hóa có hoạt tính sinh học phân hủy các hợp chất hữu cơ bao gồm cellulose, alginat và nhiều loại hydrocarbon khác nhau. Năm bộ chiếm hơn 1 % quần thể vi khuẩn trong 2 ao. Micrococcales có tiềm năng sinh học và chiếm 29,34 % quần thể ở ao A4 và 11,71 % quần thể ở ao A2. Streptomycetales là vi khuẩn sản xuất ra các hợp chất hoạt tính sinh học có tác dụng kháng khuẩn, chống ký sinh trùng và chống nấm. Streptomycetales chiếm 3,15 % mẫu ở ao A4 nhưng không phát hiện thấy ở ao A2. Frankiales giảm từ 1,33 % quần thể ở ao A4 xuống 0,02 % quần thể ở ao A2. Hai bộ cho thấy sự gia tăng quần thể: Acidibacteriales chiếm 0,82 % ở ao A4 và 3,41 % ở A2, và Kitasatosporales chiếm 0,63 % ở ao A4 và 1,97 % ở ao A2.

Proteobacteria chứa nhiều loại vi khuẩn gram âm thuộc sáu lớp. Ba trong số sáu lớp được tìm thấy trong hai mẫu; Vi khuẩn Alphaproteobacteria, vi khuẩn Betaproteobacteria, và Gammaproteobacteria.

Alphaproteobacteria được tìm thấy với số lượng lớn hơn trong ao A2 bị nhiễm nặng ở mức 43% trong khi ao A4 chỉ có 19,68 %.

Lớp này có thể phát triển ở mức chất dinh dưỡng thấp và một số kích thích cố định nitơ.

Ba bộ hàng đầu từ Alphaproteobacteria, Rhodobacterales, Hyphobacteriales và Sphingomonadales, tăng về số lượng trong ao A2 bị nhiễm nặng. Betaproteobacteria ở mức

gần như nhau trong cả hai ao với Burkholdleriales là bộ đại diện. Bộ này có phạm vi hoạt động trao đổi chất rộng và bao gồm các tác nhân gây bệnh. Gammaproteobacteria chứa các sinh vật cố định đạm, chất phân hủy xenluloza và Vibrio. Ao A4 có số lượng Gammaproteobacteria cao nhất (8,47 %) so với ao A2 (1,49 %) với Ao A4 có

nhiều Vibrionales nhất (5,99 %). Ao A4 có 8 chi khác nhau của Vibrio: alginolyticus, fortis, harveyi grp, harveyi, mytii, porteresiae, tasmaniensis, vulnificus và tỷ lệ cao, 5,46 phần trăm, của Vibrio spp không xác định. Ao A2 có 5 chi vibrio spp; fischeri, alginolyticus, harveyi, nigripulchritudo và tasmaniensis.

Các ngành bổ sung phong phú trong cả hai ao cho thấy sự dịch chuyển xuống trong ao bị nhiễm trùng nghiêm trọng bao gồm: Cyanobacteria ở mức 13,73 % đối với ao A4 và 6,49 % đối với ao A2, Bacteroidota ở mức 5,64 % đối với ao A4 và 3,46 % đối với ao A2, 5,64 % . Sự dịch chuyển lên của vi khuẩn đã được quan sát thấy đối với Planctomycetota trong ao A2 bị nhiễm trùng nghiêm trọng ở mức 7,18 %, so với 1 % đối với ao A4.

Mặc dù đã lưu ý rằng hệ vi khuẩn đường ruột khác biệt với hệ vi khuẩn trong nước ao nuôi, chúng tôi muốn xác định sự khác biệt và điểm tương đồng. Người ta cho rằng hệ vi khuẩn đường ruột có thể khác nhau do quá trình lọc và xâm chiếm môi trường (Holt 2021).

Một nghiên cứu phân tích tổng hợp đã kết hợp dữ liệu đã công bố từ các nghiên cứu về hệ vi sinh vật tôm khác nhau và xác định các vi khuẩn sau là chiếm ưu thế trong hệ vi sinh vật tôm nói chung: Proteobacteria (65,99 %), Firmicutes (16,42 %), Actinobacteria (từ đồng nghĩa Actinomycetota) (3,24 %) và Bacteroidetes (2,17 %) và Fusobacteria (0,76 %) (Cornejo-Granados 2018).

Các Phyla này đều được đại diện trong nghiên cứu của chúng tôi nhưng ở các tỷ lệ % khác nhau của quần thể với Fusobacteria dưới 1 %. Nghiên cứu phân tích tổng hợp này đã nêu bật những sự thật quan trọng về hệ vi sinh vật tôm bao gồm; sự khác biệt giữa nước biển và nước ngọt, sự khác biệt trong các giai đoạn phát triển của tôm, sự khác biệt trong các cơ quan của tôm và sự khác biệt về tính đa dạng của vi khuẩn trong bệnh tật.

Một phân tích tổng hợp khác đã nghiên cứu vi khuẩn đường ruột của tôm khỏe mạnh so với tôm bị bệnh (Yu 2018). Đường ruột khỏe mạnh của L. vannamei được chi phối bởi các thành viên của Gammaproteobacteria, Alphaproteobacteria và Bacteroides. Các Phyla bổ sung có trong đường ruột bao gồm Actinobacteria, Planctomycetes và Tenericutes.

Bệnh tôm có liên quan chặt chẽ với chứng loạn khuẩn và mức độ của chứng loạn khuẩn liên quan đến mức độ nghiêm trọng của bệnh. Ở tôm bị bệnh, trong bốn loại bệnh khác nhau, có sự giảm liên tục của Actinobacteria và Bacteroidetes nhưng lại tăng của Gammaproteobacteria. Sự giảm số lượng Actinobacteria là trong dự kiến ​​vì loài này thể hiện hoạt động kháng khuẩn được tìm thấy ở tôm khỏe mạnh.

Sự gia tăng số lượng Gammaproteobacteria sẽ được dự kiến vì nhóm vi khuẩn này chứa mầm bệnh tôm bao gồm vibrio spp. Trong nghiên cứu của chúng tôi, Proteobacteria tăng trong ao A2 bị nhiễm nặng với Alphaproteobacteria tăng và Gammaproteobacteria giảm so với

ao A4. Vì không phải tất cả vi khuẩn Vibrio spp. đều gây bệnh và một số có lợi, nên tính đa dạng của vi khuẩn Vibrio spp. trong ao A4 có thể phù hợp với giai đoạn của bệnh.

Vì WFS liên quan đến độ pH <8 và độ pH giảm có thể do phú dưỡng, chúng tôi đã xem xét một nghiên cứu về tính đa dạng của vi khuẩn trên một gradient phú dưỡng. Nghiên cứu đã xác định Actinobacteria, Proteobacteria và Cyanobacteria là Ngành chiếm ưu thế.

Actinobacteria đóng góp 20 % vào quần thể vi khuẩn trong một ao phú dưỡng cao và hơn 40 % trong một ao ít phú dưỡng. Nếu bạn so sánh gradient phú dưỡng với mức độ nghiêm trọng của bệnh thì kết quả tương đương, với 19,95 % quần thể Actinobacteria trong ao bị nhiễm nặng và 45,65 % quần thể Actinobacteria trong ao bị nhiễm ít nghiêm trọng hơn.

Có mối tương quan trực tiếp giữa chỉ số phú dưỡng, mức độ nghiêm trọng của bệnh và sự phong phú của Planctomycetes, Verrucomicrobia, Cyanobacteria và Chloroflexi. Sự phong phú của Actinobacteria và Bacteroides có mối tương quan gián tiếp với chỉ số phú dưỡng và

mức độ nghiêm trọng của bệnh. Proteobacteria là một nhóm đa dạng và không cho thấy mối tương quan với mức độ phú dưỡng. Alphaproteobacteria, một lớp trong Proteobacteria, cho thấy mối tương quan âm với mức độ phú dưỡng nhưng có mối tương quan trực tiếp với mức độ nghiêm trọng của bệnh (Kiersztyn 2019).

Các hoạt động của vi sinh vật, chẳng hạn như sự phân hủy chất hữu cơ, hô hấp và nitrat hóa, và tích tụ carbon dioxide hòa tan có thể làm thay đổi nồng độ hydro làm giảm độ pH của

nước. Độ pH thấp hơn có liên quan đến WFS và những thay đổi về sự đa dạng của vi khuẩn trong nước ao khi bệnh tiến triển tương tự như những thay đổi về sự đa dạng của vi khuẩn mà bạn sẽ thấy trong tình trạng phú dưỡng của ao. Làm thay đổi chất lượng nước trong ao bị nhiễm WFS bằng cách thêm vôi để tăng độ pH sẽ làm tỉ lệ tử vong thấp hơn (Alfiansah 2020).

Hội chứng phân trắng xảy ra sau 50 DOC khi chất lượng nước giảm xuống do độ pH thấp hơn. Tại thời điểm này, các vi khuẩn trong nước đang phản ứng với điều kiện kém, cũng như tôm. Những thay đổi về chất lượng nước ảnh hưởng tiêu cực đến vi khuẩn có lợi, tạo cơ hội cho EHP và vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào tôm. Vì điều này bắt đầu với chất lượng nước kém, việc duy trì chất lượng nước sẽ làm giảm bệnh..

4. Giải pháp

Probiotic thường được sử dụng trong môi trường nuôi trồng thủy sản để cải thiện chất lượng nước. Probiotic cũng đã được ghi nhận có thể cải thiện hệ thống miễn dịch, điều chỉnh hệ vi sinh vật đường ruột, cải thiện tình trạng dinh dưỡng và giảm bệnh. Probiotic sẽ làm tăng sự đa dạng của vi khuẩn trong ao WFS với vi khuẩn có chức năng bị mất từ ​​Actinomycetes. Khi chất lượng nước được cải thiện, sự đa dạng của vi khuẩn ban đầu sẽ được phục hồi trong cả nước và tôm. Chất lượng nước được cải thiện sẽ giúp tôm khỏe mạnh hơn và lợi nhuận cao hơn.

Nguồn: BQQ tổng hợp dịch từ World Aquaculture Society